Условие задачи
Лаборанту молекулярно-генетической лаборатории необходимо провести анализ крови человека на присутствие ВИЧ методом ПЦР. Тотальная ДНК выделена методом фенол-хлороформной экстракции, итоговая концентрация ДНК составляет 100 нг/мкл. В распоряжении лаборанта Taq-полимераза с концентрацией 2 единицы/мкл, 10x буфер для Taq-полимеразы, раствор хлорида магния с концентрацией 25 мМ, раствор четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов с концентрацией 2,5 мМ, раствор прямого и обратного праймеров, комплементарных ДНК вируса, с концентрацией 20 мМ каждый (температура отжига праймеров – 60°С), а также деионизированная вода. Размер целевого ПЦР-продукта составляет 300 пар оснований (п.о.). Общий объем реакционной смеси ПЦР составляет 25 мкл.
1. Составьте схему приготовления реакционной смеси для постановки ПЦР.
2. Напишите протокол проведения амплификации по методу классической ПЦР.
Ответ
Задание 1:
Для подготовки реакционной смеси для ПЦР необходимо взять следующие реагенты и добавить их в трубку объемом 0,2 мл:
ДНК-шаблон (100 нг/мкл) 2 мкл (200 нг ДНК)
10x буфер для Taq-полимеразы 2,5 мкл
25 мМ раствор хлорида магния 1 мкл
2,5 мМ раствор каждого дезоксинуклеотидтрифосфата 0,5 мкл
Раствор прямого праймера (20 мМ) 0,5 мкл
Раствор обратного праймера (20 мМ) ...
